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甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用.doc

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甲基 麝香 草酚兰法 试纸 中的 应用
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甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用1甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用人大附中 郑爽书 指导教师 王春摘要钙对青少年的成长发育和维持人体正常生理功能极为重要。钙代谢异常将会影响许多器官的生理功能,对于身体健康有着重要影响。因此,建立简便快速、准确性较高、成本低、易普及的钙的检测方法具有重要意义。本研究建立了利用甲基麝香草酚兰分光光度法直接测定尿钙的新方法,并且根据其原理制备了尿钙检测试纸。该方法线性范围为 0~120.0mg·L -1,回收率为 104.9%~106.4%,相对标准偏差为 0.5%,准确度、精密度均较好;尿钙试纸盲测结果与分光光度法比较,符合率为 75%,室温保存至少可稳定 70 天,性质仍然稳定。尿钙试纸使用简便、准确性较高、稳定性好,利于家庭自检及普及。关键词尿钙,甲基麝香草酚兰,分光光度法,尿钙试纸甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用2AbstractCalcium is the fifth most abundant element by mass in the human body, where it is a common cellular ionic messenger with many functions, and serves also as a structural element in bone.Calcium metabolism will affect the physiological functions of many organs. As a result, it is important to establish a new method of the determination of calcium, which is simple, rapid, high accuracy and low cost . In this paper, the new method of the determination of calcium which used MTB-Spectrophotometry was established. I also created the urine test paper in accordance with its principle. The linear range of this method is 0 ~ 120.0 mg · L-1, recovery is between 104.9% and 106.4%. The relative standard deviation is 0.5%, accuracy and precision are perfect; comparing with urine test paper blind test results and spectrophotometry , the meeting rate is 75%, and it can be kept stable for at least 70 days at room temperature, remain stable in nature. In a word, urine test paper is easy to use, high accuracy, stability, family -friendly self-inspection and penetration. It’s valuable for all of us to use it in daily life.KeywordsMTB, spectrophotometry, Urine of Ca2+, urine test paper甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用31 引言钙是人体中含量最高的无机盐类物质,也是人体内含量较多的矿物质元素,在体内仅次于氧、碳、氢、氮,居于体内元素第五位。成人体内总钙量约为 1300 g,约占人体总重量的 2%,正常人体内绝大多数的钙分布于细胞内液,主要以骨盐的形式存在于骨骼和牙齿中,约 99%在骨骼,0.5%在牙齿,0.5%在软组织。存在于细胞外液的钙仅占总钙量的 0.1%,约 1 g 左右,0.70 g 在血管外液,0.30 g 在血浆。钙的排出主要经粪便和尿,机体对粪钙排出的调节能力差,而对尿钙的排出具有一定的调节能力,血钙增多,尿钙排出增多,但很少超过 500 mg/天,血钙下降,尿钙排出减少,甚至停排 [1-2]。生命的特征之一就是代谢,钙代谢异常将会影响许多器官的生理功能,对于身体健康非常重要。人体中的钙在神经脉冲传递、触发肌肉收缩、释放激素及调节心率中起着重要作用:缺钙可以引起手足抽搐、肌肉痉挛、喉鸣、惊厥、心律失常,导致骨质钙化障碍,表现为小儿佝偻病、骨骼畸形、发育迟缓,成人骨质软化、骨质疏松等症,对孕妇、婴幼儿影响很大,对中老年人则易造成骨折;钙过量可引发胆结石、肾脏钙化、肾小管纤维化、肾小管出血等疾病,导致神经肌肉的兴奋性下降,表现为乏力、四肢松弛、记忆力减退、易疲劳、心律失常,另外,高钙血症还往往是骨瘤的主要信息,因此,钙在维持人体正常生理功能及在人类生活中地位极为重要 [3-4] , “合理补钙”已成为当代社会各年龄群体(尤其是青少年)所关注的焦点,引起了广泛重视。人体中钙的检测方法是根据钙在体内的分布和含量,选择不同的部位和方法来检测的。钙的检测方法很多,常规检测有测定骨密度、血钙、尿钙、发钙等检测途径。测定骨密度需要特殊的仪器;对于血钙、尿钙、发钙这三种检测方法来说,血钙能准确的反映体内的钙代谢情况,准确度高,但取样及样品保存要求严格的条件,并且取样有痛苦;发钙能反映出人体在一段时间内的营养状况,检测取样方便、无痛苦,但受取样部位、洗护发用品的影响较大,准确性不够高;尿钙测定取样方便、均匀性好、无痛苦,准确性虽不如血钙检测高,但却是临床检测人体钙代谢的一个重要指标,适用于普查、筛查、甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用4家庭自检 [5-9]。据有关文献报道 [10],根据北屯农十师 413 名学龄前儿童尿钙检测数据统计分析,413 名学龄前儿童钙缺乏率高达 40%;尿钙含量减少常与甲状腺机能减退症、手足抽搐症、骨质疏松症、以及肾病变等相关联;而甲状腺机能亢进、维生素 D 中毒、变形性骨炎等,均可引起尿钙增多 [11];尿钙过饱和是草酸钙结石形成的重要原因之一,因此准确测定尿液中的钙含量对于判别是否罹患尿结石有重要意义 [12]。国内测定尿钙的常见方法有 EDTA 滴定法、电极法、原子吸收法、光度法和试纸法等,首选原子吸收光谱法。 EDTA 配位滴定法优点在于不需要特殊仪器,快速方便,适宜基层医疗单位,但滴定终点难以准确掌握;电极法所用的硬度电极性能不稳定且使用寿命短;原子吸收法虽测定速度快,效果好,但需要特殊仪器及专门技术操作,在一般实验室的条件下难于应用;光度法与上述方法比较测定速度快、灵敏度及精确度高,操作相对简便。分光光度法测钙方法有邻-甲酚酞络合酮直接比色法、胶束增溶分光光度联合测钙法、偶氮胂Ⅲ显色剂测钙法等;试纸法是通过其颜色的变化对样品进行定性和半定量测定,与其它方法比较,操作简便,成本低,速度快,另外,试纸法测定无需专门培训测定人员,只要有一定的辨色能力即可,便于普通家庭使用 [13-17]。国外有利用酶分析法、光化学传感器测钙的文献报道:Tabata M. [18]于 1986 年最先报道了用磷酸酯酶测定血清中的总钙。该法测定专一,检测限较低 ,但血清中的镁对钙的测定干扰很大。后来,Yuzo [19]等以猪胰腺 α- 淀粉酶测定钙,以 2-氯-4- 硝基苯麦芽三糖(CNP-G 3)作底物,在钙存在条件下生成 2-氯-4- 硝基苯酚(CNP )和麦芽三糖(G 3) ,该反应中 Ca2+可激活 α- 淀粉酶,CNP 浓度的增加与钙离子浓度成正比例关系。此法不受各种正离子特别是镁离子及血清蛋白的干扰,但内源性的 α-胰淀粉酶将引起正误差,因此,对于急性胰腺炎患者和血钙过高患者的钙测定可能不准确。到 1996 年,Shigeki [20]等用脲酰胺酶、谷氨酸脱氢酶测定血清钙,排除了内源性铵离子的干扰,反应是钙影响了酶-ATP-Mg 2+复合物对尿素的羟化作用,钙和镁以及钙和三磷酸腺苷(ATP)之间的抑制是非竞争性的,因此,这种酶的抑制作用是与钙离子的浓度成正比,适宜的 pH 为7.5~8.0。 酶法分析耗时少,特异性好、灵敏度高,有可信的回收率,且易于自动化,以上的酶法分析已经有商品药盒出售,非常适合临床常规分析;瑞士苏黎世联邦高等理工学院(ETH )的科学家 Thomas[21]等用自己合成的一些化合物制备膜,当含钙离子的样品流经与膜接触的流通池时 Ca2+与敏感物质反应,引起光吸收的改变而测得样品溶液中的钙含量,用于钙离子检测的光纤化学传感器大多用荧光检测,荧光试剂可用天然羧酸聚醚抗菌素,将荧光试剂制成膜或直接修饰到光纤探头上,样品中的钙离子与此试剂生成配合物对荧光有熄灭作用,由于荧光熄灭程度与熄灭剂浓度有关,因此可以测定样品中钙离子的浓度。甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用5随着分析方法、通讯技术、计算机技术、生物技术、医学等学科的迅猛发展,人体中钙的检测方法也朝着更加方便、快捷、准确、无痛苦、成本低、易普及的方向发展,以适应人们对医疗条件日益提高的要求。根据文献报道,甲基麝香草酚兰分光光度法主要用于血清钙的测定 [22],直接用于尿钙的测定现未见到相关报道。甲基麝香草酚兰(即甲基百里香酚兰,MTB)是一种优良的金属络合试剂,主要用作光度法测定 Al3+、Ca 2+、Mg 2+、Hf 4+、NbO 3+和 Ti4+等的显色剂,在碱性条件下可以与钙发生显色反应,用做配位滴定法测定Zr4+、Bi 3+、Mg 2+、Sc 3+、Cu 2+等的金属指示剂。本研究有两个工作重点,首先对甲基麝香草酚兰测定尿钙的方法进行了有关显色剂最佳浓度的选择、试剂空白试验、显色反应时间、显色反应稳定性等相关条件试验,找出了其影响规律,建立了利用甲基麝香草酚兰分光光度法直接测定尿钙的方法,该方法无需对样品进行特别处理,简便易行,用于实际样品分析,得到了满意的结果;其次,在确定液相反应方法的基础上,以甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙的方法为理论基础制备尿钙试纸,对于纸质条件、浸渍溶液最佳浓度、浸纸方式及时间、干燥方式、稳定剂、衬色剂、试纸灵敏度、准确性、稳定性等方面进行了系统研究,以制备的尿钙试纸对实际尿样进行测定并与甲基麝香草酚兰分光光度法测定结果对比,结果满意。甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用62 实验部分2.1 仪器和试剂2.1.1 仪器722E 型分光光度计(上海光谱仪器有限公司) ;电子天平( Scortorius) (北京赛多利斯天平有限公司) ;微量进样器(上海医用激光仪器厂) ; pHS—3C 数字酸度计(杭州东星仪器设备厂) 。2.1.2 试剂甲基百里香酚兰(MTB) (天津瑞金特化学品有限公司) ;聚乙烯吡咯烷酮(K30 )(天津市福晨化学试剂厂) ;8-羟基喹啉(天津市化学试剂一厂) ;盐酸(天津市化学试剂六厂) ;氢氧化钠(天津市鼎盛化工材料厂) ;无水亚硫酸钠(天津市耀华化工厂) ;乙醇胺(天津市恒兴化学试剂制造有限公司) ;乙二胺四乙酸二钠(沈阳试剂四厂) ;碳酸钙(天津市科密欧化学试剂开发中心) ;海藻酸钠(国药集团化学试剂有限公司) ;柠檬黄;定量滤纸(直径 9 公分,中国杭州新华造纸厂) ;钙标准溶液(100.0 mg·L-1) (北京化工厂) ;1:1 盐酸:量取浓 HCl 试剂用等体积水稀释,摇匀,室温下保存备用;NaOH 溶液( 6 mol·L-1):称取 NaOH 24.0 g 加 100 ml 水溶解,室温下保存备用;A 液:称取 8-羟基喹啉 1.45 g,加 2.4 ml 1: 1 盐酸,加 20 ml 水,搅拌促使其溶解; 称取 0.1140 g 甲基百里香酚兰络合剂,加 1.5 g 聚乙烯吡咯烷酮(K30) ,加 0.5 L 水,搅拌促使其溶解;两液混合,定容至 1 L,棕色瓶室温保存备用;B 液(缓冲溶液):称取 2.4 g 无水亚硫酸钠,加 0.2 L 乙醇胺,加 0.7 L 水,微热,甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用7搅拌促使其溶解,定容至 1 L,室温下保存备用;显色应用液:测定前,根据标本量取用适量 A 液与 B 液等体积混匀即可(注意:混合溶液不宜长期放置,应随用随配) ;EDTA 溶液( 16.7 g·L-1):称取 16.7 g 乙二胺四乙酸二钠(Na 2H2Y·2H2O)用温水溶解,必要时过滤,冷却后用水稀释,定容至 1 L,摇匀,室温保存备用;Ca 标准溶液(300.0 mg·L-1):准确称取 0.7500 g 在 110 ℃下烘干恒重的碳酸钙,溶于 40 ml 水,再滴加 4 ml 1:1 盐酸,加水溶解,用 NaOH 溶液(6 mol·L-1)调pH=7,定容至 1 L,用的钙标准溶液(北京化工厂)校正浓度,室温下保存备用;柠檬黄溶液(0.1 g·L -1):称取 0.1 g 柠檬黄,加水 1 L 溶解,室温下保存备用;5%海藻酸钠溶液:称取 5.0 g 海藻酸钠,加 95.0 g 温水,沸水浴溶解,热水浴放置,防止其凝固(注意:最好随用随配) ;试验用水为蒸馏水,试剂为分析纯。2.2 实验方法2.2.1 尿样的采集及处理从自愿参与的男性大学生中,随机选取正常饮食的人员,收集其晨尿于 4 h 内测定;若需要长期放置尿样,需要在 1 L 尿样中加入 10 ml 6 mol·L-1 HCl 为稳定剂,临用前调至中性,再根据需要稀释(尿样中不能加入 EDTA 作为稳定剂) 。2.2.2 甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙标准曲线取 A 液、B 液等体积混匀,用 EDTA 溶液(16.7 g·L-1)调 空 白 溶 液 吸 光 度 值 为0.41~ 0.45 之 间 , 此 溶 液 为 显 色 应 用 液 。准 确 吸 取 适 量 300.0 mg·L-1 钙 标 准 溶 液 , 用 水 稀 释 至 所 需 浓 度( 30.0,60 .0,90 .0,120 .0,1 50.0,1 80.0 mg·L-1) 。在 7 支试管中,分别加入各浓度钙标准溶液 100.0 μl, 各 加入显色应用溶液 4.00 ml, 混 匀 , 室温 5 min 后,在 610 nm 波长下,用 1.0 cm 比色杯,以试剂空白调零,测定各管溶液的吸光度值 A,记录数据,并绘制标准曲线。2.2.3 尿钙样品测定甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用8取 A 液、B 液等体积混合,用 EDTA 溶液(16.7 g·L-1)调 显 色 应 用 液 空白吸光度值为 0.41~0.45 之间,收集的尿样根据需要稀释。 在试管中,加入尿样 100.0 μl, 再加入显色应用液 4.00 ml,混匀,室温 5 min 后,在610 nm 波长下,1.0 cm 比色杯,以试剂空白调零,在与标准曲线相同的条件下测定样品吸光度值 A,再由标准曲线计算出尿样含钙量。 (当样品量较少时,也可用钙标准溶液100.0 μl 替 代 尿 样 , 用 相 同 方 法 显 色 测 定 标 准 管 吸 光 度 值 , 利 用 “标 准 比 较 法 ”计 算尿 样 含 钙 量 ) 。2.2.4 尿钙试纸的制备A 4 液:称取 8-羟基喹啉 1.45 g,加 2.4 ml 1: 1 盐酸,加 20 ml 水,搅拌促使其溶解;称取 0.4560 g 甲基百里香酚兰络合剂,加 1.5 g 聚乙烯吡咯烷酮(K30) ,加 0.5 L 水,搅拌促使其溶解;两液混合,定容至 1 L,棕色瓶室温保存备用;B 液(缓冲溶液):称取 2.4 g 无水亚硫酸钠,加 0.2 L 乙醇胺,加 0.7 L 水,微热,搅拌促使其溶解,定容至 1 L,室温下保存备用;在一平皿中,取 A4 液和 B 液各 5.00 ml,用 8 μl EDTA 溶液(16.7 g·L-1)调节空白吸光度,完全浸泡定量滤纸一张,15 min 后,取出平放于干燥洁净的平面玻璃上,室温下自然晾干。制成的试纸用洁净的塑料袋密封保存。甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用93 结果与讨论本研究工作分为甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙和尿钙试纸制备两部分。第一部分的目的是建立利用甲基麝香草酚兰分光光度法直接测定尿钙的方法,同时为尿钙试纸的制备确定理论依据,因为试纸是通过其颜色的变化对样品进行定性和半定量测定的,尿钙试纸色阶的变化与尿钙含量的关系及试纸浸渍液的浓度等,均需要用分光光度法确定,此外,尿钙试纸测定结果是否准确,也需要与分光光度法对比。3.1 甲基麝香草酚兰分光光度法测定尿钙3.1.1 实验条件的确定根据相关文献 [22]的报道,确定实验的测定波长为 610 nm,测定温度为室温(20~30℃) ,A 液的 pH=2.5+0.2,B 液的 pH=12.3+0.2,显色应用液的 pH=11.8+0.2。3.1.2 显色应用液的调节甲基麝香草酚兰法对 Ca2+的灵敏度较高,试剂及实验用水中含有微量钙均有可能引入系统误差,导致标准曲线出现异常。因此,本实验用 EDTA 先将显色应用液中的微量钙加以掩蔽,通过调节试剂空白溶液的吸光度值及做标准曲线,找出其规律。室温条件下,将 A、B 溶液各 20.00 ml 混合后,用 EDTA(16.7 g/L)调节试剂空白溶液吸光度值,同时做标准曲线,在 610 nm 波长下,用 1.0 cm 比色杯,以蒸馏水调零,测定试剂空白溶液吸光度值,再以试剂空白调零,测定相应显色应用液所做标准系列的吸光度值,结果见表 1 和图 1。甲基麝香草酚兰法在尿钙试纸中的应用10表 1 试剂空白与标准曲线的关系Tab.1 The relationship between reagent blank and the standard curve——————————————————————————————————————————————————— EDTA 试剂空白 A0 试剂空白 标准曲线 A(A 0→0)——————————————————————————————————加量/μl (水→ 0) 色阶 Ca2+/ mg·L-1 30.00 60.00 90.00 120.0 150.0 180.0 0 1.376 蓝 0.120 0.137 0.156 0.226 0.306 0.37250 0.576 灰蓝 0.205 0.366 0.489 0.573 0.628 0.66660 0.447 棕灰 0.137 0.260 0.391 0.485 0.555 65 0.434 棕灰 0.133 0.279 0.403 0.512 0.593 75 0.412 棕灰 0.106 0.240 0.342 0.455 0.527 0.60680 0.395 棕灰 0.102 0.280 0.435 0.563 100 0.383 棕灰 结果表明,显色应用液加入 EDTA 可有效的调控试剂空白及标准曲线的优劣。当加入 EDTA 溶液( 16.7 g·L-1)60~75 μl使试剂空白 A0 在 0.41~0.45 之间时,标准曲线为过原点的直线,线性范围较宽;当试剂空白 A0 大于 0.45 时,溶液中残留的 Ca2+会使标准曲线的低含量点偏高,且线性范围较窄;反之,若 EDTA 过量,标准曲线低含量点偏低,均会造成测定误差,因此,实验确定调整显色应用液的试剂空白 A0 在 0.41~0.45 之间为宜。0306090120150180.0.1.20.3.40.5.60.7A A0=1.3765 0.4 A0=.12395Ca2+/ mg·L-1图 1 试剂空白与标准曲线的关系Fig.1 The relationship between reagent blank and the standard curve 3.1.3 甲基麝香草酚兰浓度对测定的影响
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