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菌株的筛选及其转化工艺优化.ppt

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菌株 筛选 及其 转化 工艺 优化
资源描述:
一株转化DHEA为7ɑ,15ɑ-OH-DHEA菌株的筛选及其转化工艺优化,www.themegallery.com,答辩人:马诗静 指导老师:李会 副教授,,,课题概述,课题概述,背景 7ɑ,15ɑ-OH-DHEA是合成口服避孕药优思明活性成分屈螺酮的重要中间体。 已有报道微生物利用其羟化酶系统从DHEA合成7ɑ,15ɑ-OH-DHEA,课题概述,目前一些菌种对DHEA的转化效果如下表所示:,课题概述,意义,目前对一些菌种转化DHEA的研究显示,这些菌种的转化率普遍不高 ,所以筛选一株高效转化DHEA的微生物并通过优化其转化工艺提高产率具有非常重要的意义。 相对于化学合成,生物转化有反应步骤少、选择性高、反应条件温和、操作简便、成本低和公害少的优点。,课题设计,目标:对筛选出的菌株的发酵所得产物进行TLC、HPLC、质谱、红外、核磁等分析,鉴定产物为7ɑ,15ɑ-OH-DHEA,并对其转化工艺进行优化以达到高产物得率的要求。,结果分析—薄层色谱法(TLC),筛选结果:赤霉菌(Gibberella intermedia )CA3-1,从薄层色谱图可以看出,提取液中有与标样在同样位置的物质,可初步说明产物可能为7ɑ,15ɑ-OH-DHEA。,结论分析—高效液相色谱法(HPLC),标准品的高效液相色谱图,样品的高效液相色谱图,标准品-样品的高效液相色谱图,,,,标准品和样品产物峰的保留时间基本一致,可以初步确定产物7ɑ,15ɑ-OH-DHEA。标准品-样品混合样的色谱图上只出现一个大峰,说明样品与标准品的出峰时间一致,可初步确定二者为同一种物质。,结果分析 — 质谱(MS),标准品的MS结果图,样品的MS结果图,二者的图谱基本一致,且通过分析可得到结果:MS(ESI) m/z [M-2H2O]+ 285。,结果分析 — 红外(IR),样品的红外谱图,IR(KBr)vmax :1680(C=O),3000(C=C),3400(-OH),结果分析 — 核磁共振(NMR),纯化样品的1H-NMR图谱,纯化样品的13C-NMR图谱,将纯化产物与Tatyana G等研究所得的7ɑ,15ɑ-OH-DHEA的图谱比对基本一致。,结果分析—转化工艺的优化,原始条件原始培养基(g/L) :酵母粉 15;玉米浆 3;葡萄糖 15 。原始培养条件:pH 6.5;温度28 ℃;发酵培养24 h后投料,投料浓度5 g/L;装液量 250 mL摇瓶装液30 mL 。,结果分析—培养基的优化,,,,A为葡萄糖、B为甘露醇、C为环糊精、D为麦芽糖、E为乳糖、F为蔗糖、G为淀粉、H为葡萄糖和淀粉从图中可以看到,产物得率最高的是以葡萄糖和淀粉为碳源的培养基。,A为大豆蛋白胨、B为豆饼粉、C为酵母粉、D为蛋白胨、E为牛肉膏、F为玉米浆、G为玉米浆和酵母粉、H为尿素、I为(NH4)2HPO3、J为(NH4)2SO4、K为NH4Cl、L为KNO3、M为NaNO3。产物得率最高的是以玉米浆和酵母粉为氮源的培养基。,从图中可以看到,产物得率最高的是添加了NaCl的培养基。,结果分析—转化条件优化,,,从图中可以看到,产物得率最高的是以初始pH6.5为发酵转化条件。,从图中可以看到,产物得率最高的是以30℃为发酵、转化条件。,从图中可以看到,产物得率最高的是以40 mL装液量为发酵转化条件。,,结果分析,菌种生长曲线,,从投料时间—产物得率图、底物浓度—产物得率图可以看到,发酵培养20 h后投料,产物得率最高;而综合各方面因素得出最佳的投料浓度为5 g/L。,,,结果分析—菌种转化曲线,从上图中可以看到,优化后的最高产物得率在80%左右,比优化前的提高了20%左右,且效率也比优化前有所提高。,结论与展望,结论筛选得到了一株转化DHEA的菌株赤霉菌(Gibberella intermedia CA3-1),其产物鉴定为7ɑ,15ɑ-OH-DHEA。确定了最佳培养基成分:葡萄糖 15 g/L,可溶性淀粉 15 g/L,酵母粉 15 g/L,玉米浆 3 g/L, NaCl 2 g/L 。最佳转化条件:初始pH 6.5,温度30 ℃,投料浓度 5 g/L,发酵培养20 h后投料,装液量40 mL。展望为了进一步提高赤霉菌的产物得率,以下几个方面值得关注:增加底物的溶解度,如添加表面活性剂、环糊精等。研究转化体系,如双水相,有机溶剂等。探讨赤霉菌的转化机理。,致谢,衷心感谢许正宏教授和李会老师细心的指导和支持!,衷心感谢大学四年来所有老师的教导和同学的帮助!,衷心感谢父母对我的默默支持和鼓励!,,敬请各位老师批评指正!,
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