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钝齿棒杆菌brnEFlysEGthrE的敲除及其对L-精氨酸积累的影响.pptx

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钝齿棒 杆菌 BRNEFLYSEGTHRE 及其 精氨酸 积累 影响
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钝齿棒杆菌brnEF / lysEG / thrE的敲除及其对L-精氨酸积累的影响,答辩人:赵芹芹学 号:0201070212导 师:窦文芳 副教授,,L-精氨酸简介,,,,,,,Description of the contents,L-精氨酸,,,化学名:α-氨基-δ-胍基戊酸分子式:C6H12N4O2M:174.20pI: 10.76,含有胍基的碱性氨基酸具强碱性,易溶于水,微溶于乙醇,不溶于乙醚。,L-精氨酸盐酸盐:C6H12N4O2·HClM:210.67,研究背景,是一种半必需氨基酸,具有重要的生理功能,是合成蛋白质、磷酸肌酸的重要原料,也是生物体内尿素循环的重要中间产物。,广泛应用于食品、医药及化工领域,,L-精氨酸的产业化现状,研究背景,,L-精氨酸生产方法,,,,,水解法,发酵法,水解法主要以毛发、蹄甲、血粉、明胶、鱼精蛋白为原料,经酸水解、分离制备,该法操作费时、收率低、污染大、成本高。,发酵法主要以钝齿棒杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等高产菌株,经发酵从发酵液中分离纯化提取L-精氨酸。节能环保。,目前形势: 我国2007年L-精氨酸的需求量约为1585t,2008年约为1900t,预计到2012年可达到3300t。水解法无法满足如此巨大的需求,且目前国内L-精氨酸主要依赖于进口,所以通过发酵法来生产L-精氨酸具有重要的工业价值,研究形势迫在眉睫。,研究背景,,传统诱变选育,,基因工程选育,从20世纪70年代到90年代,主要以传统诱变选育方法为主,诱变方法主要以紫外诱变(UV)结合化学诱变为主,前期使用亚硝基胍诱变,后期多采用复合诱变。,目前,将基因工程技术应用于L-精氨酸高产菌株选育方面已经取得了长足的进步。主要对L-精氨酸合成途径中的关键酶进行基因工程改造及对相关调控机制进行研究。,L-精氨酸高产菌株研究进展,,研究背景,C. crenatum JN50,,两次亚硝基胍诱变,抗性筛选His-,SGr 1.2mg/mL, D-Argr 15 mg/mL ,ArgHXr 10 mg/mL,,C. crenatum SPYH5-8,,基于溶氧对菌体影响的研究及分子改造,,,透明颤菌血红蛋白基因vgb 的克隆与表达,,,,,基于代谢工程的分子改造,高低溶氧条件下蛋白质组学分析,NAD激酶增强表达,膜转运蛋白的研究,,argJ基因功能研究与增强表达,argCJBD基因的克隆与增强表达,,脯氨酸合成关键酶基因ProB的敲除,,,,发酵过程中两步供养策略的提出与应用,课题组研究进展,,膜转运蛋白改造,,,,,,发酵培养基初步改进,敲除基因的确定,敲除质粒的构建,缺失菌株的发酵评价,研究用酵母粉替代玉米浆提供生长因子对C. crenatum SYPH 5-8发酵产L-精氨酸的影响。,C.crenatum SYPH 5-8发酵96 h后的胞内外游离氨基酸的含量测定和分析,确定将其氨基酸转运蛋白BrnEF、LysEG和ThrE作为研究对象。,构建敲除质粒pK18mobsacB△brnEF、pK18mobsacB△lysEG和pK18mobsacB△thrE;,构建转运蛋白缺失菌株C.crenatum SYPH 5-8△brnEF、C.crenatum SYPH 5-8△lysEG和C.crenatum SYPH 5-8△thrE,并对其进行筛选及发酵特性的初步研究,研究内容,研究内容,,研究结果,,,图1-1 不同玉米浆浓度条件下菌体生长、L-Arg合成的比较,图1-2 不同酵母粉浓度条件下菌体生长、L-Arg合成的比较,由图1-1数据分析显示,最适玉米浆浓度为25 g/L,在此条件下经96 h发酵,L-Arg产量为20.68 g/L,菌体生物量为25.47 g/L。 由图1-2分析可得,最适酵母粉浓度为10 g/L,在此条件下经96 h发酵,L-Arg产量为32.01 g/L,菌体生物量为30.50 g/L,分别较最适玉米浆浓度条件下提高了54.79 %及19.75%。,发酵培养基的初步改进,,,,,,由图2分析可得:L-Lys与L-Ile含量较高,分别占发酵液中游离氨基酸总含量的9.95 %与8.91 %,是除L-Arg(72.03%)含量最高的两种氨基酸。,图2 发酵液中游离氨基酸的含量比较,表1 胞内外游离氨基酸含量及其比较,研究结果,由表1分析可得:L-Lys、L-Ile在胞内的含量较低,在胞外的含量较高,其胞内外含量之比均相对其它氨基酸较小,说明该菌株对这两种氨基酸的转运能力较强,因而可能造成非目的代谢流量增加。,胞内外游离氨基酸的分析,图3 20种氨基酸合成概貌(均为L型),,,,,,,,研究结果,敲除基因的确定,brnEF / lysEG / thrE缺失片段的构建与克隆,图4-1 基因内缺失片段的构建,研究结果,,图4-2 brnEF缺失片段扩增的电泳图验证,图4-3 lysEG缺失片段扩增的电泳图验证,图4-4 thrE缺失片段扩增的电泳图验证,Lane 1:Marker Lane 2:brnEF同源臂A' Lane 3:brnEF同源臂B'Lane 4:brnEF同源片段 Lane 5:brnEF全基因长,Lane 1:Marker; Lane 2:lysEG同源臂A' Lane 3:lysEG同源臂B' Lane 4:lysEG同源片段,Lane 1:Marker; Lane 2:thrE同源臂A' Lane 3:thrE同源臂B'Lane 4:thrE同源片段 Lane 5:thrE全基因长,,,,由上图可见:brnEF/lysEG/thrE基因内缺失片段成功扩增,研究结果,图5-1 敲除质粒构建流程图,敲除质粒构建流程,研究结果,图4-2 pK18mobsacB△brnEF 质粒构建电泳图验证,图4-3 pK18mobsacB△lysEG 质粒构建电泳图验证,图4-4 pK18mobsacB△thrE 质粒构建电泳图验证,Lane 1:MarKer Lane 2:pMD 19-T△brnEF单酶切 Lane 3:pMD 19-T△brnEF双酶切Lane 4:pK18mobsacB△brnEF单酶切 Lane 5:pK18mobsacB△brnEF双酶切,Lane 1:pMD19-T△lysEG单酶切 Lane 2:pMD19-T△lysEG双酶切 Lane 3:pK18mobsacB△lysEG单酶切 Lane 4:pK18mobsacB△lysEG:双酶切 Lane 5:Marker,Lane 1:Marker ; Lane 2:pMD 19-T△thrE单酶切 Lane 3:pMD19-T△thrE双酶切Lane 4:pK18mobsacB△thrE单酶切 Lane 5:pK18mobsacB△thrE双酶切,,,,,由上图可见:pK18mobsacB△brnEF、pK18mobsacB △lysEG、pK18mobsacB△thrE 构建成功。,研究结果,BrnEF / LysE / ThrE缺失菌株的构建,图5-1 敲除质粒在菌体内进行同源重组的流程,研究结果,,图5-2 brnEF敲除菌株验证电泳图,图5-3 不同类型菌株在含kan平板上的生长情况,Lane 1:Marker;Lane 2:出发菌株基因组扩增brnEF Lane 3:brnEF敲除菌株基因组扩增 Lane 4:brnEF同源片段,C.C:出发菌株 0:△brnEF一次同源重组菌株 2:brnEF敲除菌株,由上图可见: C. crenatum SYPH5-8中brnEF基因成功敲除,研究结果,,,,,图5-4 lysE敲除菌株电泳验证,图5-5 不同类型菌株在含kan平板上的生长情况,Lane 1:蔗糖平板生长菌株 基因组扩增lysEGLane 2:lysEG缺失片段Lane 3:Marker,C.C:出发菌株 0:lysEG一次同源重组菌株 7:lysEG敲除菌株,由上图可见: C. crenatum SYPH5-8中lysEG基因成功敲除,,,,,图5-6 thrE敲除菌株电泳验证,图5-7 不同类型菌株在kan平板上的生长情况,Lane 1:Marker;Lane 2:蔗糖平板生长菌株基 因组DNA扩增thrE; Lane 3:thrE缺失片段,C.C:出发菌株 0:thrE一次同源重组菌株 2:thrE敲除菌株,由图可见:C. crenatum SYPH5-8中thrE基因成功敲除,研究结果,,,,,表2-1 brnEF敲除菌株发酵结果比较,表2-2 lysEG敲除菌株发酵结果比较,表2-3 thrE敲除菌株发酵结果比较,,初步发酵结果显示:brnEF的敲除对菌体产酸有一定促进作用,对菌体生长无明显作用;lysEG及thrE的敲除有利于菌体生长,对菌体产酸的影响不明显。,氨基酸转运蛋白缺失菌株的筛选及发酵特性的初步研究,研究结果,主要结论,,,,,,,,,,,,,,,,,,用酵母粉代替玉米浆进行摇瓶发酵,有利于菌体生长及产酸,产酸量达到32.01g/L,较最适玉米浆浓度下提高54.79%,菌体生物量提高19.75%,且产酸稳定,批次之间差异小。,对C.crenatum SYPH5-8发酵96h后的胞内外游离氨基酸进行分析,结合相关代谢流分析,确定敲除氨基酸转运蛋白编码基因brnEF/lysEG/thrE。,成功构建了pK18mobsacB△lysEG、pK18mobsacB△thrE、pK18mobsacB△brnEF三个敲除质粒,电击转化入C.crenatum SYPH5-8,通过两次同源重组,筛选获得多株重组子。,对敲除菌株进行初步摇瓶发酵评价,BrnEF缺失菌株与出发菌株相比较,其生长未有明显变化,其产酸存在一定差异,LysEG及thrE缺失菌株,菌体生物量增加,产酸无明显变化。,结论与展望,,,课题展望,由于时间有限,本论文仅完成了“钝齿棒杆菌brnEF、lysEG、thrE的敲除及其对L-精氨酸积累的影响”这个课题中一部分研究内容,取得了阶段性的研究成果,接下来的研究任务主要有:,C.crenatum SYPH5-8 brnEF、lysEG、thrE单基因敲除菌株的多次重复摇瓶发酵评价,及对其不同时期胞内外游离氨基酸及有机酸分析,尝试解释这三种膜转运蛋白单基因敲除对菌体生长及代谢过程的影响机制。,由初步的发酵结果显示,brnEF / lysEG / thrE的敲除对菌体的生长与产酸存在一定影响,但并不明显,通过查阅相关文献材料,L-苏氨酸与L-赖氨酸可以协同反馈抑制天冬氨酸激酶,且L-异亮氨酸与L-赖氨酸也可协同反馈抑制该酶,所以计划在已确定的单基因敲除菌株上进行三种基因组合敲除,尝试解释双基因或三基因敲除对菌株生长及代谢过程的影响机制。,结论与展望,谢谢大家!,制药工程研究室,
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