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家蝇幼虫蝇油的提取及其抗衰老作用研究.doc

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家蝇 幼虫 提取 及其 衰老 作用 研究
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本科毕业论文家蝇幼虫蝇油的提取及其抗衰老作用研究二级学院 中药学院专 业中药学(中药分析与鉴定方向)班 级 2011 级(3)班学生姓名 张志聪学 号 1006503305指导教师 王艳2015 年 4 月诚 信 声 明我声明,所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺,论文中的所有内容均真实、可信。毕业论文作者(签名): 年 月 日目 录摘要 ................................................................I1 前言 ..............................................................12 仪器、试剂与材料 ..................................................22.1 仪器 ............................................................22.2 试剂 ............................................................22.3 材料 ............................................................23 实验方法 ..........................................................33.1 蝇油的提取 ......................................................33.2 蝇油理化常数的测定 ..............................................43.3 药用软膏的制备 ..................................................53.4 蝇油软膏的抗衰老研究 ............................................63.5 蝇油的抑菌实验 ..................................................74 结果与分析 ........................................................84.1 家蝇幼虫蝇油的提取方法 ..........................................84.2 工艺验证试验 ....................................................94.3 蝇油理化性质的测定 ..............................................94.4 软膏的性状鉴别 .................................................104.5 软膏的稳定性检查 ...............................................104.6 小鼠日常活动状态和皮肤变化 .....................................104.7 体外抑菌实验 ...................................................115 讨论 .............................................................13参考文献 ...........................................................15综述 ...............................................................17致 谢 ..............................................................23家蝇幼虫蝇油的提取及其抗衰老作用研究摘要:目的 对家蝇幼虫蝇油的提取进行优选,研究家蝇蝇油的抗衰老作用和体外抑菌效果,为化妆品的开发提供理论依据;方法 通过设计正交试验优选出家蝇幼虫蝇油的提取工艺;皮下注射 D-半乳糖和紫外灯照射小鼠背部皮肤造成皮肤衰老模型,同时设空白对照和模型组研究蝇油的抗衰老作用;蝇油的体外抗菌效果;结果 70℃、2.5h,1:10 料液比为最佳提取工艺;蝇油有一定的抗衰老作用;蝇油对大肠杆菌、金色葡萄球菌和枯草杆菌均有一定的抑菌效果;结论 超声联合浸提法适合从家蝇幼虫中快速有效提取蝇油,蝇油有一定的抗衰老效果和抗菌作用。关键词:家蝇幼虫;蝇油;抗衰老;抗菌IThe extraction of the grease from Musca domestica and the study of the effect in anti-agingAbstract: Objective To optimize the best way of the extraction of the grease from Musca domestica , its effect on anti-aging and explore the effect of the antibacterial ability, which provides the theoretical basis for the development in musmetic. Method Through design the orthognal test to optimize the way of the extraction of the grease from Musca domestica, produce the aged model by subcutaneous injection with D-galactose and shine the back in mice with UV light, and projecting blank control and modle set to study the grease from Musca domestica and the result of the antibacterial in the meantime. Result The optimal condition was petroleum ether as the extraction solvent, temperature 70℃, extraction time 2.5 hours, and solvent volume 12 ml/g. The grease can take effect in anti-aging and antibacterial ability among escherichia, staphylococcus aureus and bacillus subtilis. Conclusion The ultrasound combined extraction can be used in the extraction of the grease from effciently. And the grease is effective on anti-aging and antibacterial ability.Keywords: Musca domestica; the grease from Mysca domestica; anti-aging; antibacterial 01 前言昆虫,具有生物量巨大,其繁殖速度快,分布范围广泛,同时又富含油脂等脂质类物质,脂肪含量丰富,并且其脂肪酸组成合理。大量研究表明,昆虫油脂的肪酸组成受饲料、发育、种类等条件影响,但总的说来,许多昆虫不仅含有大量的不饱和脂肪酸 [l-4],而且其脂肪酸组成更接近于鱼油,对人体有良好的保健作用。部分昆虫所含油脂的饱和、单不饱和与多不饱和脂肪酸的比例趋近于当今营养学家们推荐的人体食用最佳脂肪酸比例,具有较合理的脂肪酸组成,可作为天然的优质营养保健调和食用油。有报道称,昆虫油脂能减缓机体衰老,使人延年益寿 [5-8]。昆虫,作为地球上最大的生物资源,可在工业、农业、医药卫生、食品保健、环境保护等许多领域服务于人类社会,因此,其具有巨大的开发前景。家蝇(Musca domestica)属昆虫纲、双翅目、环裂亚目、家蝇科,是我国大部分地区最常见、数量最多的一种,虽然其生命周期短,但是具有强大的繁殖能力,繁殖过程由卵发育到幼虫,又称蝇蛆 [9]。家蝇幼虫具有很高的营养价值,其体内含有丰富的蛋白质,营养价值甚至高于鱼类,甚至被广泛应用于一些由于氨基酸缺乏而引起的疾病的治疗。有研究表明,从家蝇幼虫体内可提取到几丁质,几丁质具有辅助降血脂作用 [10],家蝇幼虫干粉的脂肪含量在 12%左右,低于一般的动物性食物而高于一般的植物性食物,脂肪含量适中,而且脂肪酸中不饱和脂肪酸(68.2%)和必需脂肪酸(36%)的含量较高,其组成接近植物油与鱼油 [11],所以,家蝇幼虫蝇油具有巨大的药用潜能。对于蝇油的提取,传统工艺以索氏提取法、浸提法、超声提取法为主,索氏提取法虽然提取的效率较高,但多适用于一般实验室的少量油脂提取;而超声法大大缩短时间,但其提取效率较低;而浸出法不仅提取效率高,其提取的油脂通过碱炼、脱色、脱臭等化工过程进行精炼,去除油脂中杂质,可使之符合国家标准,成为可食用或用于化妆品等工艺的成品油 [12],但其具有较大的时间成本,不利于实验室快速提取。本实验首次采用超声联合浸提法提取家蝇幼虫的蝇油,并且对此方法进行正交试验优选提取条件,利用自身专业课知识将蝇油制作成外用膏剂以便探究1其抗衰老作用并且研究了蝇蛆油的体外抑菌效果。2 仪器、试剂与材料2.1 仪器 2.2 试剂无水乙醇(天津市百世化工有限公司);硬脂酸(天津市富晨化学试剂厂);白凡士林(天津市科密欧化学试剂有限公司);司盘-60(天津市富晨化学试剂厂);尼泊金乙酯(天津市科密欧化学试剂有限公司);吐温-80(天津市大茂化学试剂厂);二甲苯(天津市富宇精细化工有限公司)以上均为分析纯;L-B(广东环凯生物科技有限公司);琼脂(广东环凯生物科技有限公司);单硬脂酸甘油酯(天津市百世化工有限公司);维生素 E 胶囊(青岛双鲸药业有限公司)青霉素(哈药集团制药 A080506813);链霉素(大连美罗大药厂65080605)名称 型号 厂家电子天平 BL-220H Shimadzu Corporatzon Japan万分之一天平 FA2104A 上海精天电子仪器有限公司旋转蒸发仪 重庆市永生实验仪器厂电热恒温水浴锅 江苏金坛宏华仪器厂气浴恒温振荡器 ZD-85A 江苏金坛市宏华仪器厂超净工作台 ZHJH-C1209C 上海智诚分析仪器制造有限公司数显电热培养箱 HPX-9162MBE 上海博迅实业有限公司医疗设备厂红外线电热鼓风干燥箱 CS101-3ABNR 重庆市永生实验仪器厂高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂三用紫外仪 ZF-2 型 上海市安亭仪器厂 培养皿 江苏金坛市宏华仪器厂涂布器 江苏金坛市宏华仪器厂接种环 重庆市永生实验仪器厂微量加样器 重庆市永生实验仪器厂22.3 材料家蝇幼虫(由广东省疾病预防控制中心提供本实验室传代培养);小白鼠(由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(粤)2008-0020。);伤寒杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌(均由广东药学院中山校区实验中心提供),经分离培养,没污染;青霉素(哈药集团制药 A080506813)3 实验方法3.1 蝇油的提取本文主要采用的是超声联合浸提法对家蝇幼虫蝇油进行提取,采用正交试验对提取条件进行优化筛选。3.1.1 幼虫干品的制备收集三龄幼虫经清理去杂后,放入干燥箱中干燥 24-48 h,干燥箱温度控制在 60℃左右。3.1.2 油脂的提取步骤 取家蝇幼虫干燥虫体,研磨成粉状,置于锥形瓶,按照一定的料液比溶剂的体积(mL)与家蝇幼虫干燥后粉末质量(g)之比缓慢倒入溶剂,盖上筛子于一定温度条件下超声浸提一定时间,过滤,重复提取 3 次,收集滤液,置于旋转蒸发仪中浓缩,得到蝇油,算出提取率。3.1.3 正交实验设计以料液比、提取温度和提取时间作为考察因素,设计正交试验并进行最佳条件的优选。以油脂提取率为试验指标,列出实验考察的因素及水平(表 1)。表 1:正交试验因素水平因素水平A 提取时间( h) B 提取温度(℃) C 料液比3(g:v)1 2.0 50 1:102 2.5 60 1:123 3.0 70 1:143.1.4 数据分析分析(1)家蝇蝇油提取率(%)=W 1/W2×100%式中:W 1—所提取家蝇蝇油质量(g);W2—所提取家蝇蝇油质量(g)(2)正交试验数据采用统计软件 SPSS19.0 进行分析(3)工艺验证:取家蝇幼虫干燥体 5g 三份,以 3.1.3 正交优选结果为提取条件,重复提取 3 次,计算其提取率。3.2 蝇油理化常数的测定3.2.1 溶液的配制(1)0.1mol/L氢氧化钠溶液:取4g氢氧化钠溶于蒸馏水中,并用容量瓶定容到1000ml。(2)10% 碘化钾溶液:取 10gKI 在烧杯中溶解在 100ml 容量瓶。(3)1% 淀粉溶液:可溶性淀粉 0.5g,加 5ml 水搅拌均匀后,缓慢倒入 100ml沸水中,一边加一边搅拌,继续煮沸 2 分钟,冷却,吸取上清液,即完成配制。(需临用时新鲜配制)(4)酚酞指示液:1.0g 酚酞,溶解在 100ml 无水乙醇中。(5)乙醇-乙醚混合液:体积比 1:1,临用前滴加 3 滴酚酞滴定液。(6)0.5mol/L 盐酸:90%浓盐酸 45ml,加蒸馏水定容到 1000ml。(7)0.5mol/L 乙醇制氢氧化钾溶液:取 35g 氢氧化钾固体,倒入锥形瓶,加适量无水乙醇溶解并稀释到 1000ml,塞紧橡皮塞后,静置 24 小时,迅速倾取出上清液,保存在棕色瓶。(8)0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液:25g 硫代硫酸钠,溶于经煮沸冷却后得蒸馏水,加碳酸钠 0.2g,加水稀释到 1000ml。3.2.2 蝇油酸值的测定4用 50ml 乙醇-乙醚(1:1)混合物溶剂溶解油脂 5g,振摇使样品溶解,并加入酚酞 3 滴,再用 0.1mol/L 氢氧化钾溶液滴定,同时摇动至出现微红色(30s内不褪色),记录碱液消耗的体积,平行测定三次。3.2.3 蝇油碘值的测定准确取蝇油 0.5g 至干燥的碘量瓶中,加氯仿 10ml,轻轻摇动,使样品全部溶解,准确加入溴化钾溶液,立即塞好瓶塞,同时在瓶塞与瓶口处加 10%碘化钾封闭缝隙,防止因碘挥发而产生误差,置于 20℃-30℃暗处,30 分钟后打开瓶塞,使瓶塞旁的碘化钾溶液缓慢流入碘量瓶中,并加入 10ml 10%碘化钾溶液和 100ml 蒸馏水,将瓶塞和颈部的液体冲入瓶内,摇匀后用 0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色,加入 1ml 1%淀粉指示液,继续滴定接近终点时用力振荡,使碘能从氯仿中全部进入水中,再滴定至蓝色刚好褪去,记录硫代硫酸钠的消耗量,平行测定三次并做空白对照。3.2.4 蝇油皂化值的测定取 2.0g 蝇油于锥形瓶中,加入 0.5mol/L 乙醇制氢氧化钾溶液 25ml,水浴煮沸回流一小时,待溶液变清澈透明后,加入无水乙醇 10ml 冲洗冷凝器的内壁和瓶塞的下部,滴加少许酚酞指示液使溶液呈粉红色,0.5ml 用盐酸滴定余下氢氧化钾,至粉红色恰好消失后,记录盐酸消耗的体积,平行测定 3 次并做空白对照。3.2.5 数据分析(1)物理性质:蝇油的颜色、状态及其气味。(2)酸值=V×C×56.1/m,式中V-消耗的氢氧化钾溶液体积, ml;C-氢氧化钾溶液的浓度,mol/L;m-试样的质量,g;56.1- 氢氧化钾的摩尔质量,g/mol(3)皂化值=(V 1-V2)×C×56.1/m,式中 V1-空白试样中所消耗的氢氧化钾溶液的体积,ml;V 2-实验消耗的氢氧化钾溶液体积, ml;C-氢氧化钾溶液的浓度,mol/L;m-试样的质量,g;56.1-氢氧化钾的摩尔质量,g/mol(4)碘值=(V 1-V2)×C×12.69/m,式中 V1-空白试样中所消耗的硫代硫酸钠溶液的体积,ml;V 2-实验消耗的硫代硫酸钠溶液体积, ml;C-硫代硫酸钠溶
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