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超声提取穿破石中黄酮及其活性研究.doc

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超声 提取 穿破 黄酮 及其 活性 研究
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本科毕业论文超声提取穿破石中黄酮及其活性研究二级学院 中药学院专 业中药学(中药分析鉴定方向)班 级 2011 级(3)班学生姓名 李拱涛学 号 1106503324指导教师 吴功庆2015 年 4 月诚 信 声 明我声明,所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。我承诺,论文中的所有内容均真实、可信。毕业论文作者(签名): 年 月 日目 录摘要 ................................................................I1 前言 ..............................................................12 实验仪器与试剂 ....................................................32.1 实验仪器 ........................................................32.2 实验试剂 ........................................................43 实验步骤 ..........................................................43.1 黄酮的预处理 ....................................................43.2 标准曲线的绘制 ..................................................43.3 得率的测定 ......................................................53.4 单因素实验 ......................................................53.5 响应面优化提取工艺 ..............................................63.6 大孔树脂纯化 ....................................................63.7 抗氧化性研究 ....................................................74 结果 ..............................................................94.1 标准曲线的绘制 ..................................................94.2 提取得率的测定 ..................................................94.3 单因素试验 ......................................................94.4 响应面优化提取工艺 .............................................114.5 纯化结果 .......................................................184.6 抗氧化性研究 ...................................................205 讨论 .............................................................21参考文献 ...........................................................23综述 ...............................................................26致 谢 ...........................................................38I超声提取穿破石中黄酮及其活性研究摘要:目的 以中药材穿破石为原料,研究了穿破石中黄酮类成分的提取工艺条件、大孔树脂纯化方法和抗氧化作用,为穿破石的应用提供有效的科学依据。方法 以一定浓度的乙醇作为提取溶剂,采用超声提取方法,通过提取溶剂(乙醇)体积分数、料液比、提取时间三个因素进行单因素实验,并以实验结果为基础,设计响应面实验方案,对最优提取条件进行探究并确定。纯化方面以五种型号的大孔树脂作对比,通过静态和动态吸附与解析确定最佳纯化的树脂型号。最后通过羟自由基的清除率和 DPPH 自由基清除率研究黄酮的抗氧化性。结果 以单因素实验为基础,通过响应面实验得到最佳提取条件为提取溶剂浓度为 70%乙醇,料液比 1:15,时间 30min;通过静态和动态的吸附与解析,比较 5 种大孔树脂的能力得出型号 NKA-9 树脂纯化效果最佳。最后通过羟自由基的清除率和 DPPH 自由基清除率,随浓度增加清除率变大,抗氧化效果明显。结论 响应面对穿破石黄酮提取的优化具有实际应用价值 ,大孔树脂 NKA-9 对穿破石的纯化效果显著,且穿破石黄酮有较强的抗氧化能力。关键词:穿破石黄酮;提取工艺优化;大孔树脂纯化;抗氧化能力IIUltrasonic extraction in Ventilago leiocarpa Benth of flavonoids and its active researchAbstract: Objective Make flavonoids from Ventilago leiocarpa Benth as material to study the extraction technology of nuclear polyphenols condition, macroporous resin purification methods and antioxidant effect. Provides effective scientific basis for the application of Ventilago leiocarpa Benth.Method Make one certain concentration of ethanol as extraction solvent, make use of Ultrasonic extraction method, through extraction time, extraction solvent (ethanol),liquid ratio these three facors to do the experiments alone,.On the basis of experimental results, responsing the plan of surface design experiment, exploring and determining the optimal extraction conditions.Selecting the appropriate type of macroporous resin among five kinds of macroporous resin , compare to get the optimal purification conditions, and using the method of acetic ether extraction to improve the effect of purification. Finally, we can evaluation such as the flavonoids of Ventilago leiocarpa Benth by comparing the Vc hydroxyl free radical clearance rate and the DPPH clearance rate.Results By the response surface experiments ,we can see the optimal extraction conditions is 70% of ethanol, material liquid is 1:15, extracting is 30 minutes.Comparing these selection experiments of five kinds of macroporous through the static and dynamic adsorption and resolution ,it is obvious that concluded NKA-9 macroporous resin purification effect is better.Finally through the flavonoids of Ventilago leiocarpa Benth by comparing the Vc hydroxyl free radical clearance rate and the DPPH clearance rate, clearance increases with the increasing of concentration. Conclution The method of response surface has practical application value to the flavonoids of Ventilago leiocarpa Benth extraction optimization,for the flavonoids of Ventilago leiocarpa Benth purification ,the effect of macroporous resin is remarkable,other than that, the flavonoids of Ventilago leiocarpa Benth has strong antioxidant capacity.IIIKeyWords: the flavonoids of Ventilago leiocarpa Benth; Extraction process optimization; Macroporous resin purification; Antioxidant capacity11 前言穿破石,中文学名:翼核果,拉丁学名:Ventilago leiocarpa Benth。药材来源于桑科柘属植物构棘,以根入药,全年可采,洗净切片晒干。主产于台湾、福建、广东、广西、湖南、云南。本药材性味微苦,具有祛风利湿、活血通经功效,主治风湿筋骨痛、跌打损伤、腰肌劳损、贫血头晕、四肢麻木、月经不调等,是民间常用的本草中药 [1-3],每到南方回南天气时候穿破石使用率较高。目前,有关穿破石的研究报告较少,本实验主要通过从穿破石中提取黄酮类成分进行工艺优化与性质研究,为开发穿破石的中成药提供依据。穿破石性寒凉,以化痰止咳、舒经通络、化瘀止痛、散结消肿为主,主治风湿痹痛,穿破石相对偏治肝胆、癌肿病症等,穿破石又具有护肝、抗肝纤维化、抗氧化及镇痛抗炎作用,穿破石的研究热点集中在对肝脏疾病及风湿病的治疗 [4]。目前穿破石的临床研究报道不多,而且研究并不规范,这与实验研究形成明显的反差。究其原因,可能是因为穿破石一般认为属于“草药” 、 “民族药” , 《中药学》教材一般没有收录,故临床应用并不广泛。因此,应加强并规范该药的应用研究,主要研究其在肝胆、肿瘤、风湿、心血管、糖尿病等的治疗效果,以开发出疗效确切的药物单品或成方制剂。黄酮类可看作是 2-苯基色原酮的一系列衍生物,目前黄酮类化合物是泛指具有 15 个碳原子的多元酚化合物。芳环(A 环、B 环 )之间以一个三碳链(C 环)相连,用 C6-C3-C6 表示。其中 C 环部分可以是脂链,也可以与 B 环部分形成六元或五元的氧杂环。根据三碳链氧化程度、三碳链是否成环状、B 环连接位置可以衍生出许多的结构 [5-6],因此,黄酮体化合物可分为黄酮类和黄酮醇类、二氢黄酮类和二氢黄酮醇类、查尔酮类、双黄酮类、异黄酮类以及其它黄酮类等 [7-8]。黄酮多以苷类形式存在,少数为无定型粉末。游离的苷元中,除了二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性外,其余则无;苷类由于在结构中引入糖分子,故具有旋光性,且多位左旋 [9]。 黄酮类化合物的溶解度因结构及存在状态(苷或苷元、单糖苷、双糖苷或三糖苷)不同而有很大的差异。黄酮苷类一般溶于水、甲醇、乙醇等极性强的溶剂中,难溶于或不溶于石油醚、氯仿、石油醚等低极性有机溶剂中,结构中2糖链越长水溶性越大。黄酮类化合物因分子中含有酚羟基,故显酸性,可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲酰胺中。因酚羟基数目及位置不同,酸性强弱也不同 [10]。 黄酮的显色发应有几类,主要包括:盐酸镁粉反应、钠汞齐还原反应、四氢硼钠还原反应、与金属盐类试剂的络合反应、硼酸显色反应、碱性试剂反应和与五氯化锑反应。黄酮广泛存在自然界的某些植物和浆果中,总数大约有 4 千多种,其分子结构不尽相同 [11]。不同分子结构的黄酮可作用于身体不同的器官。黄酮的功效是多方面的,第一,它是一种很强的抗氧剂,可有效清除体内的氧自由基 [12-13],本实验对穿破石中黄酮成分的抗氧化性也作出初步研究。第二,黄酮可以改善血液循环,可以降低胆固醇 [14]。第三,黄酮化合物可以降低血糖和血脂,更重要的是它还具有稳定胶原质的作用,因此它对糖尿病引起的视网膜病及毛细血管脆化有很好的作用 [15-16]。第四,黄酮可以抑制炎性生物酶的渗出,可以增进伤口愈合和止痛,栎素由于具有强抗组织胺性,可以用于各类敏感症 [17-19]。因此,对黄酮化合物的研究与利用越来越受到人们的重视,其在食品、医药、保健品和化妆品等领域的应用具有广阔的前景。目前,提取黄酮的方法主要有以下几种:(1)溶剂提取:①醇类提取:乙醇是常用的黄酮类化合物提取溶剂,高浓度的醇(如 90%-95%)适于提取苷元,60% 左右浓度的醇适于提取苷类。提取次数一般是 2 至 4 次,可用冷浸法或加热抽提法提取 [20-21]。②热水提取:仅限于提取苷类,但因提取杂质多,提取率低,故不常使用。③碱性稀醇或碱性水提取:碱性提取时,所用碱的浓度不宜过高,以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核,一般加热都在 70 摄氏度以下。提取液中加入酸,黄酮苷类即可沉淀析出,加酸酸化时,酸性也不易过强,以免生成盐,致使析出黄酮化合物又重新溶解,降低产品收率 [22]。 (2)超声波技术和微波技术强化提取:超声波技术和微波技术提取可强化浸提,缩短提取时间,提高有效成分的提取率。本实验采用超声提取技术超声波提取黄酮类物质, 在 60℃水浴中通过破坏植物细胞和细胞膜结构,从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力,有助于黄酮类化合物的释放与溶出;超声波3使提取液不断震荡,有助于溶质扩散,同时超声波的热效应使水温基本在 60℃左右,对原料有水浴作用,缩短了提取时间,提高了有效成分的提出率和原料的利用率。超声波提取操作简便快捷、无需加热、提出率高、速度快、提取物的结构未被破坏、效果好,显示出明显的优势。响应面法广泛应用于农业、化学、生化、食品、动力学研究、工程过程控制等领域。它是利用合理的试验设计并通过试验得到的一定数据,采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系,通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数,解决多变量问题的一种统计方法 [23]。本实验采用响应面分析法对穿破石黄酮提取工艺进行优化并得出结果。本次研究目的在于通过对穿破石的提取工艺优化和抗氧化性质研究,发掘穿破石中黄酮类成分的最佳提取方案和功效作用,充分提高人们对穿破石的了解,增强药材的使用率,为开发出疗效确切的药物单品或成方制剂提供科学依据。2 实验仪器与试剂2.1 实验仪器表 2-1 主要仪器仪器名称 厂家B-220 型电热恒温水浴锅 上海亚荣生化仪器厂JA-2003 型电子天平 广州仪通兴仪表有限公司RE52CS 型旋转蒸发仪器 上海亚荣生化仪器厂721 型可见分光光度计 上海现科分光仪器有限公司CL-2 型恒温加热磁力搅拌器 上海亚荣生化仪器厂SHZ-D(Ⅲ)型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司XMTB 型电热鼓风干燥箱 浙江正泰仪器仪表有限公司KQ-500M 型超声仪 东莞市科桥超声波设备有限公司42.2 实验试剂表 2-2 主要试剂试剂名称 厂家抗坏血酸(AR) 天津市天新精细化工开发中心石油醚(AR) 天津市富宇精细化工有限公司95%乙醇(AR) 天津市富宇精细化工有限公司氢氧化钠(AR) 广州化学试剂厂亚硝酸钠(AR) 广州化学试剂厂硝酸铝(AR) 广州化学试剂厂盐酸(AR) 广州市东红化工厂硫酸亚铁(AR) 天津市永大化学试剂有限公司过氧化氢(AR) 天津市百世化工有限公司大孔树脂 DA-201(AR) 沧州宝恩化工有限公司大孔树脂 X-5(AR) 上海润捷化学化学试剂有限公司大孔树脂 HPD-100(AR ) 沧州宝恩化工有限公司大孔树脂 NKA-9(AR) 沧州宝恩化工有限公司大孔树脂 D101(AR ) 沧州宝恩化工有限公司3 实验步骤3.1 黄酮的预处理预处理:购买穿破石若干,抢水洗净,置于 60℃烘箱中烘干,用中药打粉机粉碎,过 1 号筛,密封储存待用;3.2 标准曲线的绘制精确称取 10mg 芦丁标准品,用 70%乙醇溶解并定容至 100mL,充分摇匀,获得 0.1mg﹒mL -1 芦丁标准品。
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